Sự khác biệt giữa Sanger Sequencing và Pyrosequencing | Sanger Sequencing vs Pyrosequencing

Sự khác biệt chính - Sanger Sequencing và Pyrosequencing

của sự sắp xếp nucleotide chính xác trên một vùng DNA đặc biệt cho thấy nhiều thông tin quan trọng về nó. Có nhiều phương pháp lập trình DNA khác nhau. Sanger sequencing và Pyrosequencing là hai phương pháp trình tự DNA khác nhau được sử dụng rộng rãi trong sinh học phân tử. Sự khác biệt quan trọng giữa trình tự Sanger và Pyrosequencing là trình tự Sanger sử dụng dideoxynucleotides để chấm dứt việc tổng hợp DNA để đọc chuỗi nucleotide trong khi pyrosequencing phát hiện ra sự phóng thích pyrophosphate bằng cách kết hợp nucleotide và tổng hợp chuỗi bổ sung để đọc thứ tự chính xác của chuỗi.

NỘI DUNG

1. Tổng quan và Chênh lệch khác nhau

2. Sanger Sequencing là gì

3. Pyrosequencing là gì

4. So sánh từng bên - Sanger Sequencing và Pyrosequencing

5. Tóm tắt

Trình tự Sanger là gì?

Trình tự Sanger là phương pháp trình tự DNA đầu tiên được phát triển bởi Frederick Sanger và các trường đại học vào năm 1977. Nó còn được gọi là trình tự Didexy Chuỗi chấm dứt

hoặc vì nó dựa trên chấm dứt chuỗi bởi dideoxynucleotides (ddNTPs). Phương pháp này đã được sử dụng rộng rãi trong hơn 30 năm cho đến khi phát triển Hệ thống trình tự Tạo Thế hệ Mới (NGS). Kỹ thuật sắp xếp Sanger cho phép khám phá ra thứ tự nucleotide chính xác hoặc sự gắn kết của một đoạn DNA đặc biệt. Nó dựa trên sự kết hợp có chọn lọc ddNTPs và chấm dứt tổng hợp DNA trong quá trình nhân bản DNA in vitro. Sự vắng mặt của 3 'nhóm OH để tiếp tục hình thành liên kết phosphodiester giữa các nucleotide liền kề là một tính năng duy nhất của ddNTPs. Do đó, một khi ddNTP được đính kèm, xích kéo dài chấm dứt và chấm dứt từ điểm đó. Có bốn ddNTPs - ddATP, ddCTP, ddGTP và ddTTP - được sử dụng trong trình tự Sanger. Các nucleotide này ngăn quá trình nhân bản DNA khi chúng được kết hợp vào dải DNA đang phát triển và dẫn đến những đoạn DNA khác nhau. Phép điện di gel sụn được sử dụng để tổ chức các chuỗi ADN ngắn này theo kích cỡ của chúng trên gel như thể hiện trong hình 1. Hình 1: Điện di gel mao quản của DNA ngắn tổng hợp Đối với việc nhân bản DNA in vitro, nên cung cấp ít yêu cầu. Đó là các enzyme DNA polymerase, mẫu ADN, các primer oligonucleotide và các deoxynucleotides (dNTPs). Trong trình tự Sanger, sao chép DNA được thực hiện trong bốn ống nghiệm riêng biệt cùng với bốn loại ddNTPs riêng biệt. Deoxynucleotides không hoàn toàn được thay thế bởi các ddNTPs tương ứng. Một hỗn hợp của dNTP cụ thể (ví dụ: dATP + ddATP) được bao gồm trong ống và được nhân bản lại. Bốn sản phẩm ống riêng biệt được chạy trên một gel trong bốn giếng riêng biệt. Sau đó bằng cách đọc gel, trình tự có thể được xây dựng như thể hiện trong hình 2. Hình 2: Trình tự Sanger

Trình tự Sanger là một kỹ thuật quan trọng giúp trong nhiều lĩnh vực sinh học phân tử. Dự án bộ gen con người đã được hoàn thành với sự trợ giúp của các phương pháp dựa trên trình tự Sanger. Trình tự Sanger cũng hữu ích trong việc xác định trình tự DNA mục tiêu, nghiên cứu bệnh ung thư và di truyền, phân tích biểu hiện gen, nhận dạng con người, phát hiện mầm bệnh, lập trình vi khuẩn …

Có một số nhược điểm của trình tự Sanger:

sequenced không thể dài hơn 1000 cặp base Chỉ có một sợi có thể được sắp xếp theo trình tự tại một thời điểm. Quá trình này tốn nhiều thời gian và tốn kém.

Do đó, kỹ thuật lập trình tiên tiến mới đã được phát triển với thời gian để khắc phục những vấn đề này. Tuy nhiên, trình tự Sanger vẫn đang được sử dụng do kết quả chính xác cao lên đến khoảng 850 đoạn cơ sở chiều dài cặp.

Pyrosequencing là gì?

Pyrosequencing là một kỹ thuật sắp xếp DNA mới dựa trên "trình tự bằng tổng hợp". Kỹ thuật này dựa vào sự phát hiện của sự phóng thích pyrophosphate khi kết hợp nucleotide. Quá trình này được sử dụng bởi bốn loại enzyme khác nhau: DNA polymererse, ATP sulfurylase, luciferase và apyrase và hai chất nền là adenosine 5 'phosphosulfate (APS) và luciferin.

Quá trình bắt đầu với sự kết hợp primer với mẫu ADN đơn sợi và DNA polymerase bắt đầu sự kết hợp của các nucleotide bổ sung cho nó. Khi các nucleotide kết hợp với nhau (trùng hợp với axit nucleic), nó giải phóng nhóm pyrophosphate (hai nhóm phosphate liên kết với nhau) và năng lượng. Mỗi bổ sung nucleotide giải phóng số lượng pyrozofat tương đương. Pyrophosphate chuyển đổi thành ATP bằng ATP sulfurylase trong sự hiện diện của chất nền APS. ATP tạo ra sự chuyển đổi luciferin qua trung gian luciferase sang oxyluciferin, tạo ra ánh sáng khả kiến ​​với số tiền tương ứng với lượng ATP. Ánh sáng được phát hiện bởi một thiết bị phát hiện photon hoặc bởi photomultiplier và tạo ra một chương trình pyrogram. Apyrase làm giảm ATP và các dNTP không kết hợp trong hỗn hợp phản ứng. dNTP bổ sung được thực hiện một lần tại một thời điểm. Kể từ khi bổ sung nucleotide được biết theo kết hợp và phát hiện ánh sáng, chuỗi các mẫu có thể được xác định.Pyrogram được sử dụng để tạo ra trình tự nucleotide của DNA mẫu như thể hiện trong hình 3. 999 Pyrosequencing là rất quan trọng trong phân tích đa hình nucleotide và sắp xếp các đoạn DNA ngắn. Độ chính xác cao, tính linh hoạt, dễ dàng tự động hóa và xử lý song song là những ưu điểm của quá trình pyrosequencing trên kỹ thuật sắp xếp Sanger.

• Hình 3: Sự xuất hiện của Pyro
• Sự khác nhau giữa Sanger Sequencing và Pyrosequencing là gì?
• Sanger Sequencing & Pyrosequencing

Trình tự Sanger là một phương pháp lập trình DNA dựa trên sự kết hợp chọn lọc của ddNTPs bởi DNA polymerase và sự kết thúc của chuỗi.

Pyrosequencing là một phương pháp trình tự DNA dựa trên sự phát hiện của sự phóng thích pyrophosphate khi kết hợp nucleotide.

Việc sử dụng ddNTP

ddNTP được sử dụng để chấm dứt sự sao chép DNA ddNTPs

không được sử dụng.

Enzyme liên quan đến DNA polymerase

được sử dụng.

Bốn enzyme được sử dụng: DNA polymerase, ATP sulfurylase, Luciferase và Apyrase.

Chất liệu Được sử dụng
APS và Luciferin không được sử dụng.	Adenosine 5 'phosphosulfate (APS) và luciferin được sử dụng.
Nhiệt độ tối đa
Đây là một quá trình chậm.	Đây là quy trình nhanh.
Tóm tắt - Sanger Sequencing và Pyrosequencing
Trình tự Sanger và Pyrosequencing là hai phương pháp lập trình DNA được sử dụng trong sinh học phân tử. Trình tự Sanger cấu trúc trình tự của các nucleotide theo trình tự bằng cách chấm dứt sự kéo dài chuỗi, trong khi pyrosequencing xây dựng thứ tự chính xác của các nucleotide theo trình tự bằng cách kết hợp nucleotide và phát hiện ra sự phóng thích của pyrophosphates. Vì vậy, sự khác biệt chính giữa trình tự Sanger và Pyrosequencing là trình tự Sanger làm việc theo trình tự bằng cách chấm dứt chuỗi, trong khi pyrosequencing làm việc theo trình tự bằng tổng hợp.	Tài liệu tham khảo:
1. Fakruddin, Md và Abhijit Chowdhury. "Phép toán tiếp theo-Một cách thay thế cho trình tự sắp xếp truyền thống Sanger. "Tạp chí Sinh học và Công nghệ Sinh học Hoa Kỳ. Xuất bản khoa học, 02 tháng 3 năm 2012. Web. 28 tháng 2 năm 2017.
2. "Trình tự Sanger. "Sanger sequencing - Các chủ đề Khoa học. N. p., n. d. Web. 28 tháng 2 năm 2017	Hình ảnh Nhã nhảnh:
1. "Didesoxy-Methode" Tác giả: Christoph Goemans (modifiziert) - Tiến sĩ Norman Mauder, nguyên bản của Christoph Goemans (CC BY-SA 3. 0) qua Commons Wikimedia
2. "Sanger-DNA-seq" của Enzo tại Wikipedia tiếng Ba Lan (CC BY-SA 3. 0) thông qua Commons Wikimedia	3. "Pyrosequencing" của vi sinh vật học (CC BY-SA 2. 0) thông qua Flickr